Ultraestructura y fisiología de los ovocitos de oveja vitrificados

león

En la década de los años 50 fue cuando se inició en la práctica la congelación de semen, ya que se descubrió el primer crioprotector (sustancia que protege a los espermatozoides de los efectos dañinos de la congelación): el glicerol. Un año después nació el primer ternero fruto de la aplicación de la inseminación artificial con semen congelado. A partir de ese momento la congelación se comenzó a utilizar en otros tipos de células, aunque no sería hasta 1972 cuando se consiguió el primer éxito en la congelación de embriones.

El objetivo de la congelación de células reside en su preservación a lo largo del tiempo, manteniendo su viabilidad y funcionalidad. En el caso de los gametos, ya sean espermatozoides u ovocitos, se trata de conseguir congelar estas células para su posterior utilización en técnicas de reproducción asistida (inseminación artificial, fecundación in vitro , transferencia de embriones) sin las limitaciones del espacio y del tiempo (es decir, realizarlo cuando se desee y en el lugar que se quiera sin necesidad de transportar animales enteros) y aprovechando las características genéticas de elevada calidad de animales seleccionados. A estas ventajas hay que añadir el hecho de que se rentabiliza mucho más que en la reproducción natural el uso de las células sexuales, ya que se controla hasta el detalle el número de estas células utilizadas en el caso de la reproducción asistida.

En el caso de los ovocitos, las ventajas radican en la disponibilidad de los mismos para la fecundación in vitro , el cultivo de embriones con diversos fines científicos así como otras tecnologías reproductivas a realizar en mamíferos como la transferencia nuclear o la microinyección de genes. Un ovocito fecundado hace posible el comercio internacional de material genético de alto valor, transportando embriones congelados con un coste muy inferior al que resultaría al hacerlo con animales y con un menor riesgo de accidentes y de transmisión de enfermedades.

En el caso de animales de especies en peligro de extinción las ventajas resultan obvias y si se trata de explotaciones ganaderas, aquéllas provienen del ahorro que supone el mantener un menor número de hembras seleccionadas genéticamente (ya que unas pocas actuarían como donantes de ovocitos de alto valor genético).

Congelación

Así las cosas, los científicos tratan de mejorar las técnicas de congelación de estas células pero el hecho físico derivado supone que se formen cristales de hielo en el interior de las mismas, lo que supone un aumento del tamaño del interior por efecto del incremento del volumen del agua congelada con la consiguiente desestructuración y pérdida de viabilidad de la célula. Por tanto, se trata de evitar la formación de estos cristales en el interior del ovocito eliminando las moléculas de agua mediante una deshidratación adecuada o evitando la formación de cristales de hielo controlando la velocidad de congelación, ya que esta se relaciona con el tamaño de los cristales formados.

A partir de 1985 los investigadores comenzaron a desarrollar un nuevo método de congelación: la vitrificación. En ella, una solución líquida es congelada a tasas muy elevadas, de forma tal que la congelación es tan rápida que se impide que se formen cristales de hielo y su posterior crecimiento, dando lugar a un sólido particular llamado cristalino. Curiosamente, este extraño estado sólido mantiene la misma distribución molecular e iónica que el estado líquido.

Ana Rocío Díaz, bajo la dirección de los profesores de la Universidad de León Paulino de Paz y Luis Anel, ha desarrollado una investigación en la que el objetivo general es el análisis del efecto que distintos protocolos de vitrificación tienen sobre la capacidad de maduración nuclear y de maduración citoplásmica de los ovocitos de oveja. Para ello se hizo un estudio de la distribución de los distintos componentes de la ultraestructura del ovocito como son: los microfilamentos de actina, los microtúbulos, los cromosomas, los gránulos corticales y las mitocondrias. También se incluyeron pruebas para determinar el estado metabólico de los ovocitos después de la vitrificación (determinación del ATP y determinación del metabolismo general de la glucosa).

Para alcanzar este análisis se plantearon una serie de objetivos específicos como son el estudio preliminar de la maduración nuclear y análisis ultraestructural de ovocitos vitrificados mediante cuatro métodos de vitrificación: diferentes pajuelas y sistemas inmersión en nitrógeno líquido. También se determinó la maduración nuclear y citoplásmica en función de los dos métodos de vitrificación seleccionados en el estudio preliminar y se hizo una determinación de la maduración nuclear y citoplásmica de ovocitos vitrificados en función del tamaño del folículo así como una determinación de la maduración nuclear y citoplásmica de ovocitos vitrificados en estado de vesícula germinal (VG), es decir, inmaduros, y de ovocitos vitrificados después de la maduración in vitro .

Entre las conclusiones del trabajo cabe reseñar que los ovocitos vitrificados en estado de VG se desarrollan en baja proporción hasta el estado de metafase II después de la desvitrificación. El mejor método de vitrificación de este grupo de ovocitos, es mediante pajuelas SOPS e inmersión directa en nitrógeno líquido. Los ovocitos maduros, en cambio, se caracterizan por presentar porcentajes altos de daño a nivel nuclear. En este grupo de ovocitos no existen diferencias significativas entre los métodos de vitrificación.

Vitrificación

Los ovocitos vitrificados en estado inmaduro y los vitrificados en estado maduro, experimentan un gran daño en los microtúbulos del huso meiótico. Este daño es debido principalmente a una intensa despolimenzación de los microtúbulos provocando su desaparición.

Los ovocitos vitrificados en estado inmaduro presentan lesiones en el citoesqueleto de actina tanto a nivel de la banda de actina como de las proyecciones zonales que conectan el ovocito y las células del cúmulus. En ovocitos vitrificados en estado maduro, los daños que experimenta la actina a nivel citoplasmático son responsables de los cambios de forma producidos en algunos ovocitos después de la vitrificación. Los gránulos corticales en ovocitos inmaduros vitrificados no muestran cambios en la distribución como consecuencia del proceso de crioconservación. En cambio, los ovocitos vitrificados después de la maduración presentan una mayor agregación y degeneración de los gránulos corticales y la presencia de grandes vacuolas corticales.