Caracterización funcional de una proteína con actividad polivalente

Después de la secuenciación del genoma humano, queda por asignar la función a innumerables proteínas. En determinadas ocasiones es posible asignar funciones por comparación de su secuencia con otras proteínas conocidas. Sin embargo, en el caso de una enzima, la proteína objeto de la investigación desarrollada por los autores de este artículo en la Universidad de León, llamada maleilacetoacetato isomerasa (MAAI), la comparación de secuencias puede inducirnos a errores respecto a la función de esta proteína. Esta enzima fue clonada en 1997 y clasificada como una nueva clase de glutatión transferasa (GST), la clase Z, por comparación de secuencias, a pesar de que los autores no fueron capaces de demostrar actividad GST. Independientemente, en nuestro grupo clonamos la enzima MAAI, esto es, la enzima perteneciente a la ruta catabólica de fenilalanina y tirosina que convierte el maleilacetoacetato (MAA) en su isómero, el fumarilacetoacetato (FAA). Además de estas actividades, se ha encontrado otra actividad enzimática asociada a esta proteína, mediante la que realiza la deshalogenación oxidativa del ácido dicloroacético para convertido a glioxilato. El ácido dicloroacético (propuesto como cancerígeno) se origina en la cloración del agua y se utiliza como terapia en la acidosis láctica. En esta tesis hemos encontrado que la MAAI es capaz de utilizar como sustratos nuevos compuestos halogenados (además de los ya descritos). Esta nueva capacidad deshalogenativa es importante para la eliminación de estos compuestos halogenados orgánicos, ya que son un importante grupo de contaminantes, muchos de los cuales son tóxicos y persistentes en el medio ambiente, tendiendo a acumularse en aguas superficiales, suponiendo tanto una amenaza para el ecosositema como para el ser humano. Degradación de tóxicos En este estudio también hemos confirmado y estudiado la conversión (isomerización) del maleato a fumarato mediada por la MAAI. En mamíferos no se había descrito ninguna actividad enzimática que degrade el ácido maléico (compuesto tóxico). Solamente hemos encontrado algunas referencias de los años 50 y 60, en que se describe la observación de que rodajas de riñón de conejo pueden convertir el maleato en D-malato. En microorganismos sí se han caracterizado dos enzimas que convierten el maleato a fumarato o a malato. Ambas han sido sometidas a patentes debido a la gran importancia industrial de los ácidos maléico y fumárico. Hemos observado en ratones deficientes en MAAI que algunos de ellos presentan esteatosis (acumulación de lípidos) hepática. La isomerización de dobles enlaces en configuración cis a trans es absolutamente necesaria para poder catabolizar ácidos grasos en los que estos doble enlaces están presentes. Se sabe, que la enzima purificada es capaz de isomerizar muchos sustratos y pudiera ser que su deficiencia de lugar a la acumulación de algún tipo de ácido graso o intermediario metabólico del metabolismo lipídico al no ser convertido. En el futuro, debemos confirmar el papel de la MAAI en la esteatosis hepática ensayando, in vitro, la isomerización de enlaces cis a trans en los ácidos grasos que hemos encontrados acumulados en el hígado de ratones esteatósicos. Esto es importante ya que nuestro país se encuentra a la cabeza en el número de donantes de hígado por millón de habitantes por encima de otros países más desarrollados como EEUU o la Unión Europea. El número de personas que vive con un transplante de órgano sólido se incrementa año tras año en España y cada vez existe mas sensibilización de la sociedad acerca de la importancia y el impacto que esta terapia presenta en el sistema nacional de salud. El pasado año no se transplantaron más de 300 hígados por presentar estaeatosis hepática en las distintos estadios de la enfermedad, siendo importante realizar un estudio con el modelo animal para dar el salto a la investigación clínica e intentar encontrar una solución a esta enfermedad que puede convertirse en el futuro en un importante problema de salud pública a nivel mundial. Caracterización de un gen Otra parte del estudio de este trabajo de investigación, que dio lugar a una tesis doctoral, fue la caracterización del gen phacB. Este gen esta implicado en la ruta catabólica de fenilacetato y fenilalanina en el hongo Aspergillus nidulans. La mayoría de los organismos vivos utilizan un número reducido de rutas catabólicas, comunes a todos ellos, para obtener energía y compuestos estructurales a partir de materia orgánica. Aspergillus nidulans cataboliza compuestos orgánicos derivados del ácido fenilacético. Usando técnicas de sustracción de DNA aislamos un gen, denominado phacB, que está fuertemente inducido por dicho ácido (y sus derivados), y codifica un nuevo citocromo (una proteína transformadora) P450. El análisis de reacciones in vitro, con microsomas de la cepa silvestre y varias cepas mutantes, mediante cromatografía líquida de alta resolución y cromatografía de gases-masas, confirmó que este citocromo cataliza una reacción bioquímica (hidroxilación en posición 6 del anillo aromático para generar 2,5-dihidroxifenilacetato y 2,4,5-trihidroxifenilacetato, respectivamente). Ambos compuestos son utilizados como substratos por una enzima que también utiliza PhAc como substrato para generar 2-hidroxifenilacetato, aunque con una baja eficacia. El gen phacB ha sido descrito como el primer miembro de una nueva subfamila de CYP450 denominada CYP504B.